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牛结核病防治技术规范

2012-08-07来源:山东畜牧网访问次数:字号:[ ]
  牛结核病(Bovine Tuberculosis)是由牛型结核分枝杆菌(Mycobacterium bovis)引起的一种人兽共患的慢性传染病,我国将其列为二类动物疫病。

为了预防、控制和净化牛结核病,根据《中华人民共和国动物防疫法》及有关的法律法规,特制定本规范。

1 适用范围

本规范规定了牛结核病的诊断、疫情报告、疫情处理、防治措施、控制和净化标准。

本规范适用于中华人民共和国境内从事饲养、生产、经营牛及其产品,以及从事相关动物防疫活动的单位和个人。

2 诊断

2.1 流行特点

本病奶牛最易感,其次为水牛、黄牛、牦牛。人也可被感染。结核病病牛是本病的主要传染源。牛型结核分枝杆菌随鼻汁、痰液、粪便和乳汁等排出体外,健康牛可通过被污染的空气、饲料、饮水等经呼吸道、消化道等途径感染。

2.2 临床特征:

潜伏期一般为3~6周,有的可长达数月或数年。

临床通常呈慢性经过,以肺结核、乳房结核和肠结核最为常见。

肺结核:以长期顽固性干咳为特征,且以清晨最为明显。患畜容易疲劳,逐渐消瘦,病情严重者可见呼吸困难。

乳房结核:一般先是乳房淋巴结肿大,继而后方乳腺区发生局限性或弥漫性硬结,硬结无热无痛,表面凹凸不平。泌乳量下降,乳汁变稀,严重时乳腺萎缩,泌乳停止。

肠结核:消瘦,持续下痢与便秘交替出现,粪便常带血或脓汁。

2.3 病理变化:

在肺脏、乳房和胃肠粘膜等处形成特异性白色或黄白色结节。结节大小不一,切面干酪样坏死或钙化,有时坏死组织溶解和软化,排出后形成空洞。胸膜和肺膜可发生密集的结核结节,形如珍珠状。

2.4 实验室诊断

2.4.1 病原学诊断

采集病牛的病灶、痰、尿、粪便、乳及其它分泌物样品,作抹片或集菌处理(见附件)后抹片,用抗酸染色法染色镜检,并进行病原分离培养和动物接种等试验。

2.4.2 免疫学试验

牛型结核分枝杆菌PPD(提纯蛋白衍生物)皮内变态反应试验(即牛提纯结核菌素皮内变态反应试验)(见GB/T 18646)。

2.5 结果判定

本病依据流行病学特点、临床特征、病理变化可做出初步诊断。确诊需进一步做病原学诊断或免疫学诊断。

2.5.1 分离出结核分枝杆菌(包括牛结核分枝杆菌、结核分枝杆菌)判为结核病牛。

2.5.2 牛型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验阳性的牛,判为结核病牛。

3 疫情报告

3.1 任何单位和个人发现疑似病牛,应当及时向当地动物防疫监督机构报告。

3.2 动物防疫监督机构接到疫情报告并确认后,按《动物疫情报告管理办法》及有关规定及时上报。

4 疫情处理

4.1 发现疑似疫情,畜主应限制动物移动;对疑似患病动物应立即隔离。

4.2 动物防疫监督机构要及时派员到现场进行调查核实,开展实验室诊断。确诊后,当地人民政府组织有关部门按下列要求处理:

4.2.1 扑杀

对患病动物全部扑杀。

4.2.2 隔离

对受威胁的畜群(病畜的同群畜)实施隔离,可采用圈养和固定草场放牧两种方式隔离。

隔离饲养用草场,不要靠近交通要道,居民点或人畜密集的地区。场地周围最好有自然屏障或人工栅栏。

对隔离畜群的结核病净化,按本规范5.5规定进行。

4.2.3 无害化处理

病死和扑杀的病畜,要按照GB16548-1996《畜禽病害肉尸及其产品无害化处理规程》进行无害化处理。

4.2.4 流行病学调查及检测

开展流行病学调查和疫源追踪;对同群动物进行检测。

4.2.5消毒

对病畜和阳性畜污染的场所、用具、物品进行严格消毒。

饲养场的金属设施、设备可采取火焰、熏蒸等方式消毒;养畜场的圈舍、场地、车辆等,可选用2%烧碱等有效消毒药消毒;饲养场的饲料、垫料可采取深埋发酵处理或焚烧处理;粪便采取堆积密封发酵方式,以及其它相应的有效消毒方式。

4.2.6 发生重大牛结核病疫情时,当地县级以上人民政府应按照《重大动物疫情应急条例》有关规定,采取相应的疫情扑灭措施。

5 预防与控制

采取以“监测、检疫、扑杀和消毒”相结合的综合性防治措施。

5.1 监测

监测对象:牛

监测比例为:种牛、奶牛100%,规模场肉牛10%,其它牛5%,疑似病牛100%。如在牛结核病净化群中(包括犊牛群)检出阳性牛时,应及时扑杀阳性牛,其它牛按假定健康群处理。

成年牛净化群每年春秋两季用牛型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验各进行一次监测。初生犊牛,应于20日龄时进行第一次监测。并按规定使用和填写监测结果报告,及时上报。

5.2 检疫

异地调运的动物,必须来自于非疫区,凭当地动物防疫监督机构出具的检疫合格证明调运。

动物防疫监督机构应对调运的种用、乳用、役用动物进行实验室检测。检测合格后,方可出具检疫合格证明。调入后应隔离饲养30天,经当地动物防疫监督机构检疫合格后,方可解除隔离。

5.3人员防护

饲养人员每年要定期进行健康检查。发现患有结核病的应调离岗位,及时治疗。

5.4 防疫监督

结核病监测合格应为奶牛场、种畜场《动物防疫合格证》发放或审验的必备条件。动物防疫监督机构要对辖区内奶牛场、种畜场的检疫净化情况监督检查。

鲜奶收购点(站)必须凭奶牛健康证明收购鲜奶。

5.5 净化措施

被确诊为结核病牛的牛群(场)为牛结核病污染群(场),应全部实施牛结核病净化。

5.5.1 牛结核病净化群(场)的建立

5.5.1.1 污染牛群的处理:应用牛型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验对该牛群进行反复监测,每次间隔3个月,发现阳性牛及时扑杀,并按照本规范4规定处理。

5.5.1.2犊牛应于20日龄时进行第一次监测,100~120日龄时,进行第二次监测。凡连续两次以上监测结果均为阴性者,可认为是牛结核病净化群。

5.5.1.3凡牛型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验疑似反应者,于42天后进行复检,复检结果为阳性,则按阳性牛处理; 若仍呈疑似反应则间隔42天再复检一次,结果仍为可疑反应者,视同阳性牛处理。

5.5.2 隔离

疑似结核病牛或牛型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验可疑畜须隔离复检。

5.5.3 消毒

5.5.3.1 临时消毒:奶牛群中检出并剔出结核病牛后,牛舍、用具及运动场所等按照4.2.5规定进行紧急处理。

5.5.3.2 经常性消毒:饲养场及牛舍出入口处,应设置消毒池,内置有效消毒剂,如3~5%来苏尔溶液或20%石灰乳等。消毒药要定期更换,以保证一定的药效。牛舍内的一切用具应定期消毒;产房每周进行一次大消毒,分娩室在临产牛生产前及分娩后各进行一次消毒。

6 控制、净化标准

6.1 县(市、区)净化标准

县(市、区)净化标准必须具备以下三个条件:

6.1.1 全县(市、区)范围内连续两年按种牛、奶牛100%、规模场的肉牛10%、其它牛5%的比例进行监测,每年牛型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验阳性率在0.05%以下。

6.1.2 检出的结核阳性牛全部就地扑杀,并作无害化处理。

6.2 市(地、盟)净化标准

全市(地、盟)所有县(市、区)达到净化标准。

6.3 省(区、市)净化标准

全省(区、市)所有县(市、区)达到净化标准。

6.4 全国净化标准

全国所有省(区、市)均达到净化标准。







附件

样 品 集 菌 方 法



痰液或乳汁等样品,由于含菌量较少,如直接涂片镜检往往是阴性结果。此外,在培养或作动物试验时,常因污染杂菌生长较快,使病原结核分枝杆菌被抑制。下列几种消化浓缩方法可使检验标本中蛋白质溶解、杀灭污染杂菌,而结核分枝杆菌因有蜡质外膜而不死亡,并得到浓缩。

1 硫酸消化法

用4-6%硫酸溶液将痰、尿、粪或病灶组织等按1:5之比例加入混合,然后置37℃作用1-2小时,经3000-4000rpm离心30分钟,弃上清,取沉淀物涂片镜检、培养和接种动物。也可用硫酸消化浓缩后,在沉淀物中加入3%氢氧化钠中和,然后抹片镜检、培养和接种动物。

2 氢氧化钠消化法

取氢氧化钠35-40g,钾明矾2g,溴麝香草酚兰20mg(预先用60%酒精配制成0.4%浓度,应用时按比例加入),蒸馏水1000mL混合,即为氢氧化钠消化液。

将被检的痰、尿、粪便或病灶组织按1:5的比例加入氢氧化钠消化液中,混匀后,37℃作用2-3小时,然后无菌滴加5-10%盐酸溶液进行中和,使标本的pH调到6.8左右(此时显淡黄绿色),以3000-4000rpm离心15-20分钟,弃上清,取沉淀物涂片镜检、培养和接种动物。

在病料中加入等量的4%氢氧化钠溶液,充分振摇5-10分钟,然后用3000rpm离心15-20分钟,弃上清,加1滴酚红指示剂于沉淀物中,用2N盐酸中和至淡红色,然后取沉淀物涂片镜检、培养和接种动物。

在痰液或小脓块中加入等量的1%氢氧化钠溶液,充分振摇15分钟,然后用3000rpm离心30分钟,取沉淀物涂片镜检、培养和接种动物。

对痰液的消化浓缩也可采用以下较温和的处理方法:取1N(或4%)氢氧化钠水溶液50mL,0.1mol/L柠檬酸钠50mL,N-乙酰-L-半胱氨酸0.5g,混合。取痰一份,加上述溶液2份,作用24-48小时,以3000rpm离心15分钟,取沉淀物涂片镜检、培养和接种动物。

3 安替福民(Antiformin)沉淀浓缩法

溶液A:碳酸钠12g、漂白粉8g、蒸馏水80mL。

溶液B:氢氧化钠15g、蒸馏水85mL。

应用时A、B两液等量混合,再用蒸馏水稀释成15-20%后使用,该溶液须存放于棕色瓶内。

将被检样品置于试管中,加入3-4倍量的15-20%安替福民溶液,充分摇匀后37℃作用1小时,加1-2倍量的灭菌蒸馏水,摇匀,3000-4000rpm离心20-30分钟,弃上清沉淀物加蒸馏水恢复原量后再离心一次,取沉淀物涂片镜检、培养和接种动物。





动物结核病诊断技术
GB/T 18645-2002

1、范围
 本标准规定了动物结核病的检测方法和要求。。
 本标准适用于动物结核病检测。

  2、定义、符号和缩略语
 本标准采用下列符号和缩略语:
  PPD:提纯蛋白衍生物(purified protein derivative)。
  IU:国际单位(international unit)。

  3 、 细菌学检查
  3.1 病料的采集和处理
 用于细菌学检查的材料采自淋巴结及其他组织。当活畜有可疑的呼吸道结核、乳房结核、泌尿生殖道结核、肠结核时,其痰、乳、精液、子宫分泌物、尿和粪便可作为细菌学检查的材料。
 对那些结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验阳性,但尸检时无病理学病变的动物,可从下颌、咽后、支气管、肺(特别是肺门及肺门淋巴结)、纵隔及一些肠系膜的淋巴结采集样品送检。
 样品应封装在无菌的容器内冷藏运送。
 为了提高检出结果,样品可采取消化浓缩法处理,处理方法见附录A(标准的附录)。
  3.1.1痰
  对牛常可用痰进行细菌学检验。牛咯痰极少,宜在清晨采集。用硬橡胶管自口腔伸人至气管内,外端连接注射器吸取痰液。亦可取牛咳出的疾块进行检验。
 痰样品稀薄时,可加人等量的4%~6%硫酸(见附录A中A3)处理,如痰样品粘稠时,则加入5倍量的4%硫酸处理。充分摇匀后置37℃作用20min,以3000r/min~4000 r/min离心,沉淀物作染色镜检、培养和动物试验。
  也可用2倍量15%~20%安替福民(antiformin)溶液(见附录A中A3)处理痰液,将混合物置37℃作用lh~2h后离心。以灭菌生理盐水冲洗沉淀物几次后,取沉淀物染色镜检、培养和动物试验。
  3.1.2乳
怀疑有乳房结核时,可无菌采集乳汁进行检验(一般以挤出之最后乳汁含菌量较多,早晨挤出的乳中含菌量最高)。
将乳汁分置 4~6支离心管中,每管 10 mL,以 3000 r/min~4000r/min离心20 min~30 min,吸取上层乳脂和管底的沉淀物作染色镜检、培养和动物试验。
  乳汁10mL加酒精和乙醚各10mL及15%~20%安替福民溶液30mL,摇匀置37℃恒温箱内lh~2h,取出加等量灭菌蒸馏水混匀,离心沉淀后弃去上清,取沉淀物作染色镜检、培养和动物试验。
  3.1.3 精液和子宫分泌物

在生殖道结核可疑时,可采集公畜精液、母畜子宫分泌物进行细菌学检查。处理子宫分泌物,可用15%~20%安替福民溶液,混匀后静置2h~3h,3000r/min~4000r/min离心20min,弃上清,加10ml,蒸馏水于沉淀物中。即可作动物试验,经1.5~2个月剖检。
  3.1.4尿
  有肾结核可疑时,可采集尿液,一般采集中段尿液,以早晨第一次尿为宜。
  如仅作染色镜检,可将尿液以3000r/4000r/min离心20min后,取沉淀物涂片。
  如作培养或动物试验,则应将尿液进行消化浓缩处理,再进行检验以免杂菌生长而影响检验结果。
  3.1.5粪便
  有肠结核可疑时,可采集粪便进行细菌学检查,患肺结核的牛只,有时在粪便中亦可检出结核分枝杆菌。因牛常将痰液吞咽至消化道中,随粪便排出。尽量采集混有粘液或脓血的粪便。
  取粪便30g,加15%~20%安替福民溶液15ml和蒸馏水55ml,混合,经2h~3h后,3000r/min~4000r/min离心30min,倾去上清液,加10ml蒸馏水于沉淀物中,将此液用纱布过滤后接种于豚鼠皮下,经1.5~2个月后剖检。
  或将粪便加2倍量灭菌蒸馏水磨碎,然后加氯化钠至饱和。当液体中残渣沉淀后(液体完全澄清),浮起的薄膜含有大量的结核分枝杆菌。取出薄膜,用等量的4%氢氧化钠(见附录A中A2)充分混合,置37℃中3h,然后离心,取沉淀物用8%盐酸中和后,即可作染色镜检、培养和动物试验。
  粪便中如有粘液或脓血,可挑取粘液脓血选用任何一种消化液处理后检验。
  如系纯粪便,取5g~10g,加生理盐水约3~4倍混合后,用细铜纱网过滤,取滤液置室温中自然沉淀,然后取上层悬液置于另一大离心管或烧杯内,加消化液约3~4倍量,置37℃温箱1h~2h,同上法处理后检验。
  3.1.6组织器官
  尽量采集有结节病灶的部位。猪易患颈部淋巴结结核、亦易患肠系膜淋巴结核,且常呈钙化或干烙样病变。家禽常在肠、脾、肝发生结核病灶,有时亦可见于肺或卵巢。
  病变组织需先研磨,制成乳剂,通常取组织乳剂或其他液状病2ml~4ml,加入等量的5%氢氧化钠溶液,充分振摇5min~10min,或摇至发生液化为止,液化后经3000r/min~4000r/min离心15min~30min,沉淀物加1滴酚红作指示剂,以2mol/L盐酸中和至淡红色后,作染色镜检、培养和动物试验。
  如病料为脓状或干酪状或钙化的结节病灶组织,可直接作染色镜检,往往可以检出众多的结核分枝杆菌。但得到阴性结果时,应浓缩处理后检验。

  3.2检验方法
  3.2.1染色镜检
  3.2.1.1涂片
  先在玻片上涂布一层薄甘油蛋白(鸡蛋白20ml,甘油20ml,水杨酸钠0.4g,混匀),然后吸取标本滴加其上,涂布均匀。
  如检验标本为乳汁等含脂肪较多的材料,在涂片制成后,可先用二甲苯或乙醚滴加覆盖于涂片之上,经摇动1min~2min脱脂后倾去,再滴加95%酒精以除去二甲苯,待酒精挥发后即可染色。
  3.2.1.2染色
  染色液配制方法见附录B(标准的附录)。
  萋-尼氏抗酸染色:处理过的被检材料涂片后,经火焰固定,加苯酚复红染色液(见附录B中B1)覆盖,将玻片上在火焰上加热至出现蒸汽(不能产生气泡),如此热染5min(如染色液干涸,须加适量补充)。水洗后滴加3%盐酸酒精(见附录B中B2)脱色30s~60s(至无色素脱下为止)。水洗后,以骆氏美蓝染色液(见附录B中B3)复染1min。水洗,吸干,镜检。抗酸菌应不被盐酸酒精脱色而染成红色,其他细菌与动物细胞可被盐酸酒精脱色而均被染成蓝色。
  3.2.1.3镜检
  结核分枝杆菌在显微镜下呈细长平直或微弯曲的杆菌,长1.5μm~5μm,宽0.2μm~0.5μm,在陈旧培养基上或干酪性淋巴结内的菌体,偶尔可见长达10μm或更长。
  3.2.2培养
  3.2.2.1培养基配制方法见附录C(标准的附录)
  3.2.2.2被检标本经消化浓缩后吸取其沉淀物作为培养材料。初次分离,可用配氏培养基(见附录C中C1)、L-j培养基(见附录C中C2)或青霉素血液琼脂培养基(见附录C中C3)。
  3.2.2.3将经过处理的标本接种到培养基上(同时作2~4份),培养一天后,以熔化的石蜡封口,继续培养。
  3.2.2.4牛型结核分枝杆菌比人型结核分枝杆菌生长要缓慢得多。初次培养牛型结核分枝杆菌时,需36℃~37℃培养5~8周方可出现菌落。在固定培养基上不产生任何颜色,菌落湿润、略显粗糙并发脆。加1%的丙酮酸钠能促进生长,但在噻吩-2酸肼(T2H)培养基(见附录C中C4)上不生长。
  3.2.2.5禽型结核分枝杆菌生长需要2~3周。形成湿润、弥漫状,光滑及星光状菌落。最适生长温度为40℃~42℃。在T2H培养基上生长。
  3.2.2.6 人型结核分枝杆菌生长需要36℃~37℃培养3~4周。该菌落干燥、粗糙,呈白色、黄色或橙色。牢牢附着于培养基。在T2H培养基上生长。
  3.2.2.7非典型分枝杆菌生长快速,大部分(但不是全部)产生白色或具有橙色或黄色色素,常形成黄色或橙色菌落。某些种类的色素只有在亮处才显出。大多数典型种类的生长速度比牛或人型结核分枝杆菌快。
  3.2.3动物试验
  本试验是确诊结核病的重要依据,如能与涂片镜检和培养同时进行,则结果更为可靠。
  3.2.3.1试验动物在试验前,应进行牛型结核分枝杆菌PPD和禽型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验。
  3.2.3.2豚鼠对牛型和人型结核分枝杆菌高度敏感,对禽型结核分枝杆菌有抵抗力,常只能形成局部病灶。
  3.2.3.3家兔对禽型结核分枝杆菌高度敏感。对牛型结核分枝杆菌敏感。人型结核分枝杆菌虽可使其肺部形成少量病灶,但可趋于痊愈而不致死。
  3.2.3.4处理过的病料约1ml~3ml,皮下或肌肉或腹腔内注射,每份病料至少接种2只同种动物。接种后30d左右,进行禽型结核分枝杆菌PPD和牛型结核杆菌PPD皮内变态反应试验,如有阳性反应,可剖检其中的半数动物进行病理学观察,细菌培养和涂片镜检。另一半继续观察至3个月再剖检观察。如果为阴性反应,可于40d左右剖检其中的半数,观察病理学变化、细菌培养和涂片镜检,另一半继续观察3个月再剖检观察。
  3.2.4牛型、禽型和人型结核分枝杆菌鉴定方法见附录D(指示的附录)。

  4、结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验
  4.1牛型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验
  用结核分枝杆菌PPD进行的皮内变态反应试验对检查活畜结核病是很有用的。该试验用牛型结核分枝杆菌PPD进行。
  4.1.1牛的牛型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验
 出生后20d的牛即可用本试验进行检疫。
  4.1.1.1操作方法
  a注射部位及术前处理:将牛只编号在颈侧中部上三分之一处剪毛(或提前一天剃毛),三个月以内的犊牛,也可在肩胛部进行,直径约10cm。用卡尺测量术部中央皮皱厚度,作好记录。注意,术部应无明显的病变。
b)注射剂量:不论大小牛只一律皮内注射0.1ml(含2000IU)。即将牛型结核分枝杆菌PPD稀释成每毫克2万IU后,皮内注射0.1ml。冻干PPD稀释后当天用完。
C)注射方法:先以75%酒精消毒术部,然后皮内注射定量的牛型结核分枝杆菌PPD,注射后局部应出现小疱,如对注射有疑问时,应另选15cm以外的部位或对侧重作。
d)注射次数和观察反应:皮内注射后经72h判定,仔细观察局部有无热痛、肿胀等炎性反应,并以卡尺测量皮皱厚度,作好详细记录。对疑似反应牛应立即在另一侧以同一批PPD同一剂量进行第二回皮内注射,再经72h观察反应结果。
对阴性牛和疑似反应牛,于注射后96h和120h再分别观察一次,以防个别牛出现较晚的迟发型变态反应。
4.1.1.2结果判定
a) 阳性反应:局部有明显的炎性反应,皮厚差大于或等于4.0mm。
b) 疑似反应:局部炎性反应不明显,皮厚差大于或等于2.0mm、小于4.0mm。
c) 阴性反应:无炎性反应。皮存差在2.0mm以下。
凡判定为疑似反应的牛只,于第一次检疫60d后进行复检,其结果仍为疑似反应时,经60d再复检,如仍为疑似反应,应判为阳性。
4.1.2其他动物牛型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验
参照牛的牛型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验进行。
4.2禽型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验
禽型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验是最广泛使用于家禽的试验。牛及其他哺乳动物也可用牛型结核分枝杆菌PPD和禽型结核分枝杆菌PPD同时在不同的部位进行,以区分特异性和非特异性变态反应。
4.2.1禽的禽型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验
4.2.1.1操作方法
用10mm×0.5mm针头肉垂皮内注射0.1ml(025万IU)禽型结核分枝杆菌PPD,48h后观察结果。
4.2.1.2结果判定
阳性反应为接种部位肿胀,从5.0mm直陉的小硬结到扩展至其他肉垂与颈部的广泛性水肿。火鸡肉垂的结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验,没有家禽的试验那样可靠。其他禽类也可用翼蹼作试验,但结果一般不理想。水禽可接种脚蹼,但试验不敏感并经常与接种部位的感染相混淆。
4.2.2牛的禽型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验
4.2.2.1操作方法
与牛型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验相同,只是禽型结核分枝杆菌PPD的剂量为每头0.1ml,含0.25万IU。即将禽型结核分枝杆菌PPD稀释成每毫升含2.5万IU后,皮内注射0.1ml。
4.2.2.2结果判定
a )对牛型结核分枝杆菌PPD的反应为阳性(局部有明显的炎性反应,皮厚差大于或等于4.0mm),并且对牛型结核分枝杆菌PPD的反应大于对禽型结核分枝杆菌PPD的反应,二者皮差在2.0mm以上,判为牛型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验阳性。
对已经定性为牛型结核分枝杆菌感染的牛群。其中即使少数牛的皮差在2.0mm以下,甚至对牛型结核分枝杆菌PPD的反应略小于对禽结核分枝杆菌PPD的反应(反应差小于或等于2.0mm),只要对牛型结核分枝杆菌PPD的反应在2.0mm以上,也应判定为牛型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验阳性牛。
b)对禽型结核分枝杆菌PPD的反应大于对牛型结核分枝杆菌PPD的反应,两者的皮差在2.0mm以上,判为禽型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验阳性。
对已经定性为副结核分枝杆菌或禽型结核分枝杆菌感染的牛群。其中即使少数牛的皮差在2.0mm以下,甚至对禽型结核分枝杆菌PPD的反略小于对牛型结核分枝杆菌PPD的反应(不超过2.0mm),只要对禽型结核分枝杆菌PPD的反应在2.0mm以上,也应判为禽型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验阳性牛。

附录A
(标准的附录)
标本消化浓缩法
痰液或乳汁等样品,由于含菌量较少,如直接涂片镜检往往是阴性结果。此外,在培养或作动物试验时,常因污染杂菌生长较快,使病原结核分枝杆菌被抑制。下列几种消化浓缩方法可使检验标本中蛋白质溶解、杀灭污染杂菌,而结核分枝杆菌因有蜡质外膜而不死亡,并得到浓缩。

A1硫酸消化法
用4%~6%硫酸溶液将痰、尿、粪或病灶组织等按1:5之比例加入混合,然后置37℃作用1h~2h,经3000r/min~4000r/min离心30min,弃上清,取沉淀物涂片镜检、培养和接种动物。也可用硫酸消化浓缩后,在沉淀物中加入3%氢氧化钠中和,然后抹片镜检、培养和接种动物。

A2氢氧化钠消化法
取氢氧化钠35g~40g,钾明矾2g,溴麝香草酚蓝20mg(预先用60%酒精配制成0.4%浓度,应用时按比例加入)、蒸馏水1000ml混合,即为氢氧化钠消化液。
将被检的痰、尿、粪便或病灶组织按1:5的比例加入氢氧化钠消化液中,混匀后,37℃作用2h~3h,然后无菌滴加5%~10%盐酸溶液进行中和,使标本的PH调到6.8左右(此时显淡黄绿色),以3000r/min~4000r/min离心15min~20min,弃上清,取沉淀物涂片镜检、培养和接种动物。
在病料中加入等量的4%氢氧化钠溶液,充分摇荡5min~10min,然后用3000r/min离心15min~20min,弃上清,加1滴酚红指示剂于沉淀物中,用2mol/L盐酸中和至淡红色,然后取沉淀物涂片镜检、培养和接种动物。
在痰液或小脓块中加入等量的1%氢氧化钠溶液,充分振荡15min,然后用3000r/min离心30min,取沉淀物涂片镜检、培养和接种动物。
对痰液的消化浓缩也可采用以下较温和的处理方法:取1mol/L(或4%)氢氧化钠水溶液50ml,0.1mol/L柠檬酸钠50mL,N-乙酰-L-半胱氨酸0.5g混合。取痰一份,加上述溶液2份,作用24h~48h,以3000r/min离心15min,取沉淀物涂片镜检、培养和接种动物。

A3安替福民(antiformin)沉淀浓缩法
溶液A:碳酸钠12g、漂白粉8g、蒸馏水80ml。
溶液B:氢氧化钠15g、蒸馏水85ml。
应用时A、B两液等量混合,再用蒸馏水稀释成15%~20%后使用,该溶液须存放于棕色瓶内。
将被检样品置于试管中,加入3~4倍量的15%~20%安替福民溶液,充分摇匀后37℃作用1 h,加1~2倍量的灭菌蒸馏水,摇匀,3 000 r/min~4 000 r/rain离心20 min~30 min,弃上清沉淀物加蒸馏水恢复原量后再离心一次,取沉淀物涂片镜检、培养和接种动物。

附 录 B
(标准的附录)
萋一尼氏抗酸染色液配制方法
B1苯酚复红染色液
碱性复红饱和酒精溶液(每100 mL95%酒精加3 g碱性复红)10 mL,5%苯酚溶液90 mL,二者混合后用滤纸滤过。

B2 3%盐酸酒精脱色液
浓盐酸3 mL,95 9,6酒精97 mL,混匀。

B3 骆氏美蓝染色液
甲液:美蓝0.3 g,95%酒精30 mL。
乙液:O.01%氢氧化钾溶液
将甲乙两液相混合。
附录C
(标准的附录)
培养基配制方法
C1 配氏(Petragnane)培养基
C1.1成分
新鲜脱脂牛奶450ml,马铃薯淀粉18g,天门冬素(或蛋白胨)2.6g,去皮马铃薯225g,鸡蛋15个(除去3个蛋清),甘油40g,2%孔雀绿水溶液30ml。

C1.2制法
将马铃薯去皮擦成丝,加入马铃薯淀粉、天门冬素(或蛋白胨)、脱脂牛奶置烧杯中水浴煮沸40min-60min,并不时搅拌均匀,使成糊状。待冷却至50℃时加入打碎的鸡蛋(蛋壳先用75%酒精消毒洗净),混匀后用四层纱布过滤除渣。最后加入甘油和孔雀绿水溶液搅拌均匀,分装于灭菌的试管中。
将分装培养基的试管置血清凝固器(或流通蒸汽锅)内,间歇灭菌3次,每天一次,第一天65℃灭菌30min,第二、三天75℃-80℃灭菌30min。

C1.3用途
分离培养结核分枝杆菌用。

C2 L-J(Lowenstein-Jensen)培养基
C2.1成分
无水磷酸二氢钾(KH2PO4)2.4g,硫酸镁(MgSO4.HO2)0.24g,枸橼酸镁0.6g,DL-天门冬素(DL-Asparagin)3.6g,甘油12g,蒸馏水600ml,马铃薯粉30g,鸡蛋(约30个)1000ml,2%孔雀绿水溶液20ml。

C2.2制法
将磷酸二氢钾、硫酸镁、枸橼酸镁、甘油和蒸馏水混合’,加热使溶解。取马铃薯粉加入上述溶液内,随加随搅拌,水浴煮沸1 h。鸡蛋用75%酒精消毒外壳后,打开,将蛋清和蛋黄充分搅匀,4层纱布过滤。待上述加马铃薯粉的盐溶液冷却至50℃时,加入鸡蛋液和孔雀绿,并充分搅匀。
分装,80℃灭菌30 min后,37℃培养48 h,若无杂菌污染即可使用。

C2.3用途
供培养结核分枝杆菌用。

C3 青霉素血液琼脂培养基

C3.1 成分
琼脂1.5 g,中性甘油1 mL,蒸馏水74 mL,兔全血(或牛全血)25 mL,青霉素(2 000 IU/mL)1.85 mL。
C3.2制法
将琼脂、中性甘油及蒸馏水混合,经103.4 kPa 15 min灭菌。待冷却到50~C时加入兔全血(或牛全血)与青霉素,混合后分装,经37℃培养48 h,无杂菌污染即可使用。

C3.3用途
供培养结核分枝杆菌用。

C4 噻吩一2酸肼(T2H)培养基
C4.1 成分
L—J培养基,TzH。

C4.2制法
取L—J培养基(见C2)100 mL,水浴煮沸,加TzH。1 mg,充分搅匀。分装,80~C灭菌30 min后,37lC培养48 h,若无杂菌污染即可使用。

C4.3用途
供结核分枝杆菌生化鉴定用。

附 录D
(提示的附录)
牛型、禽型和人型结核分枝杆菌鉴定
牛型、禽型和人型结核分枝杆菌的鉴定,主要依据生化试验和动物试验。
D1生化试验
牛型、禽型和人型结核分枝杆菌的生化试验特性见表D1。

表D1
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  

  

生化试验类型


  

烟酸试验


  

Tween-80


  

水解试验


  

耐热接触酶试验


  

硝酸盐还原试验


  

尿素酶试验


  

T2H抗性试验


  

牛型结核分枝杆菌


  

-


  

-


  

-


  

-


  

+


  

-


  

禽型结核分枝杆菌


  

-


  

-


  

+


  

-


  

-


  

+


  

人型结核分枝杆菌


  

+


  

±


  


  

+


  

+


  

+


  

D1.1烟酸试验
D1.1.1试验方法
以热蒸馏水浸泡固体培养基上的培养物15 min~30 min,洗下。每个培养物分装入2支试管中,每管0·4 mL,再加入3%联苯胺乙醇溶液0.2 mL。然后向其中一管加入10%溴化氰溶液(此液剧毒,应在通风橱内操作)0.2 mL。
D1.1.2结果判定
凡含10%溴化氰溶液的试管出现桃红色沉淀,另一管只产生无色沉淀者判为阳性;两支试管都为产生无色沉淀者判为阴性。
D1.2吐温一80(Tween一80)水解试验
D1.2.1试验方法
向100 mL磷酸缓冲液(1/15 mol/L,pH 7.O)中加入O。5 mL Tween一80、2 mL O.2%中性红溶液。经112 kPa灭菌20 min,分装于试管中,每管2 mL。在4℃~10℃可保存2周。
取上述试管,加入10 mg/mL的菌液O.5 mI。,37℃培养,3 d~5 d观察结果。
D1.2.2结果判定
试管内由原来的琥珀色变为桃红色或红色者判为阳性。无颜色变化为阴性。
D1.3耐热接触酶试验
D1.3.1试验方法
用生理盐水配制出5 mg/mL~10 mg/mL的菌液,分装试管,每管0.5 mL,以68℃水浴20 rain,冷却后加入O.5 mL过氧化氢(H20。)和Tween一80混合液(10%Tween一80加等量30%H20。)。观察结果。
D1.3.2结果判断
肉眼观察,如有多量小气泡自管底升起,即为阳性。否则为阴性。
D1.4硝酸盐还原试验
D1.4.1试验方法
在100 mL pH7.o的磷酸盐缓冲液中,加入硝酸钠(NaN0。·H20)85 mg,经112 kPa灭菌20 min后分装,每管2 mL。。 .
向上述溶液中加入10 mg/mL的菌液,经37℃水浴2 h后,加入1滴2倍稀释的盐酸,2滴0.2%氨苯磺胺,2滴O.1%N一甲基盐酸二氨基乙烯。在4℃~10℃存放2周后判断结果。
D1.4.2结果判定 ‘
呈粉红色至紫红色者为阳性。无色或淡粉色为阴性。
D1.5尿素酶试验
D1.5.1试验方法
将被检材料接种尿素培养基。37℃培养。
D1.5.2结果判定
在尿素培养基上长出结核分枝杆菌菌苔(或菌落),并且使培养基变成红色,即为阳性。培养基不变色为阴性。
D1.6 T2H抗性试验
D1.6.1试验方法
将被检材料接种TzH培养基和L—J培养基。37℃培养。
D1.6.2结果判定
在上述两种培养基上长出结核分枝杆菌菌苔(或菌落)即为阳性。若在L—J培养基上生长,而在TzH培养基上不生长,则为阴性。 D2动物试验
牛型、禽型和人型结核分枝杆菌的动物试验特性见表D2。
表D2
  


  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  

试验动物


豚鼠




牛型结核分枝杆菌


易感


易感


不易感


禽型结核分枝杆菌


不易感


易感


易感


人型结核分枝杆菌


易感


不易感


不易感



D2.1试验方法
  试验动物在试验前,应进行结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验。豚鼠用牛型结核分枝杆菌PPD检测;鸡用禽型结核分枝杆菌PPD检测;兔用牛型和禽型结核分枝杆菌PPD检测。
  将处理过的病料约1 mL~3 mL,选用皮下、肌肉或腹腔内途径注射试验动物,每份病料至少接种2只同种试验动物。
接种后30 d左右,对豚鼠用牛型结核分枝杆菌PPD检测;对鸡用禽型结核分枝杆菌PPD检测;对兔用牛型结核和禽型结核分枝杆菌PPD检测。如有阳性反应,可剖检其中的半数动物进行病理学观察、细菌培养和涂片镜检。另一半继续观察至3个月再剖检观察。如果为阴性反应,可于40 d左右剖检其中的半数,观察病理学变化、细菌培养和涂片镜检,另一半继续观察至3个月再剖检观察。
D2.2结果判定
D2.2.1 牛型结核分枝杆菌感染
鸡用禽型结核分枝杆菌PPD检测阴性,无任何病变,细菌培养和涂片镜检都未见到结核分枝杆菌。同时从豚鼠和兔检测到结核分枝杆菌,或豚鼠和兔的牛型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验阳性并观察到典型病理变化。
D2.2.2禽型结核分枝杆菌感染
豚鼠用牛型结核分枝杆菌PPD检测阴性,无任何病变,细菌培养和涂片镜检都未见到结核分枝杆菌。同时,从兔和鸡检测到结核分枝杆菌。或兔或鸡的禽型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验阳性并观察到典型病理变化。
D2.2.3人型结核分枝杆菌感染
仅从豚鼠检测到结核分枝杆菌。或仅豚鼠的牛结核分枝杆攻PPD皮内变态反应试验阳性并观察到典型病理变化。


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