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狂犬病诊断技术

2012-08-07来源:山东畜牧网访问次数:字号:[ ]
  

  

  
  
GB/T18639—2002

  

  
1 范围

  
本标准规定了狂犬病内基氏小体(negribodies)检查、免疫荧光试验、小鼠和细胞培养物感染试验的技术要求。

  
本标准适用于各种易感动物的狂犬病的诊断和检疫。

  
2 内基氏小体检查

  
2.1 准备

  
2.1.1 器材

  
胶皮手套、口罩、防护眼镜等个人防护器具;骨锯、骨凿、骨剪、脑刀等动物解剖器具;切片机、染色缸等组织制片与染色器具;光学显微镜等。

  
2.1.2 标本保存液

  
10%(体积分数)福尔马林溶液,50%(体积分数)甘油生理盐水。

  
2.1.3 染色液

  
赛勒(Seller)氏染色液,曼(Mann)氏染色液,其配制方法见附录A(标准的附录)。

  
2.1.4 人身防护

  
见附录B(提示的附录)。

  
2.2 样品的采集和运送

  
2.2.1 对可疑为狂犬病而扑杀或死亡的动物(含实验感染小鼠),应在死亡后3h内(越早越好)由大脑海马回(Ammon氏角)、小脑皮质和延髓各切取lcm3组织数块,放人灭菌玻璃瓶,再置于冰瓶内于24h内送达实验室。

  
2.2.2 不能立即送检者,应加10%福尔马林溶液固定,或加50%甘油生理盐水,4℃保存送检。

  
2.2.3 不能就地取脑时,小动物可送检完整的新鲜尸体,大动物可送检未剖开的头颅。

  
2.3 标本片的制备

  
2.3.1 对新鲜脑组织,可用外科刀切开,以通过火焰去脂的载玻片在其切面上触压一下制成压印片。每张载玻片可接触2~3个部位,每份材料做3~4张。

  
2.3.2 在甘油盐水中保存的新鲜病料,应先用生理盐水彻底洗去甘油,方可制片,制片方法同2.3.1。

  
2.3.3 所有压印片于室温下干燥后,浸入甲醇溶液固定2min。

  
2.3.4 经10%福尔马林溶液充分固定过的脑组织可按常规方法制备组织学切片。

  
2.4 染色

  
2.4.1 赛勒氏染色法

  
在经过甲醇固定并风干的压印片上,滴加赛勒氏染色液(以盖满压印面而不温为度)着染5s~10s,然后用蒸馏水冲洗,干燥后镜检。

  
2.4.2 曼氏染色法

  
2.4.2.1 将经过甲醇固定并风干的压印片,或者经过脱蜡、浸水、风干的切片浸入曼氏染色液中浸染。压印片浸染5min,切片浸染时间因温度而异(室温下24h,或38℃温箱中12h,或60℃温箱中2h)。

  
2.4.2.2 以蒸馏水快速洗去染色液,至无浮色出现为止,用吸水纸吸干。

  
2.4.2.3 以无水乙醇稍洗,至标本区刚出现蓝色为度。

  
2.4.2.4 浸入碱性乙醇分化15s~20s,至标本区出现红色。

  
2.4.2.5 依次通过无水乙醇和蒸馏水各数秒钟,分别洗上氢氧化钠和乙醇,再浸入微酸性水中lmin~2min。酸化期间,经常于显微镜下观察,至细胞核出现蓝色为宜;如果核蓝色过深,说明酸化过度,可退回至碱性乙醇,再作短时分化。

  
2.4.2.6 以蒸馏水水洗后,依次通过95%乙醇和无水乙醇脱水,并经二甲苯透明,最后加香胶封固。

  
2.5 显微镜检查及判定

  
内基氏小体嗜酸性,位于神经细胞胞浆中,呈圆形、椭圆形或棱形,直径3um~20um,一个细胞内通常含有一个内基氏小体,但也可含有几个。用赛勒氏染色时,内基氏小体呈桃红色,神经细胞为蓝紫色,组织细胞为深蓝色。用曼氏染色时,内基氏小体为鲜红色,神经细胞的胞核为蓝色、胞浆为淡蓝色,红细胞为粉红色。有时,在鲜红色的内基氏小体中还可以见到嗜碱性的蓝色小颗粒。

  
内基氏小体即狂犬病包涵体,为狂犬病所特有。因此,一旦检出内基氏小体,即可确诊。但在检查犬脑时,应注意与犬瘟热病毒引起的包涵体相区别。犬瘟热包涵体主要出现于呼吸道、膀胱、肾盂、胆囊、胆管等器官粘膜上皮细胞的胞浆和胞核内。在脑组织内,见于原浆细胞和一些小胶质细胞的核内,在神经原内很少见到。

  
3 免疫荧光试验

  
3.1 材料准备

  
3.1.1 器材

  
荧光显微镜,恒温箱,载玻片(片厚2mm以下),盖玻片,冰冻切片机。

  
3.1.2 试剂

  
3.1.2.1 异硫氰酸荧光黄(FITC)标记抗狂犬病病毒丙种球蛋白(以下简称狂犬病荧光抗体)和未标记抗狂犬病病毒丙种球蛋白(以下简称狂犬病未标记抗体),由制标单位提供。使用时,用0.02%伊文思蓝(Evansblue)染色液稀释成2~4个染色单位。例如,荧光抗体染色效价为1:64,则作1:32~1:8稀释后使用。

  
3.1.2.2 丙酮(分析纯)使用前置普通冰箱内预冷至4℃左右。

  
3.1.2.3 0.01mol/L pH7.4磷酸盐缓冲盐水(PBSS)。

  
3.1.2.4 0.02%伊文思蓝染色液。

  
3.2 样品的采取和运送

  
同2.2。

  
3.3 标本片的制备

  
3.3.1 病料标本片制备

  
3.3.1.1 按照2.3的方法和要求制得压印片,也可由切面刮取脑细胞泥均匀涂成直径约lcm的圆形涂抹面,或者参照常规方法将被检脑组织制成厚度在5um~8um的冰冻切片。

  
3.3.1.2 标本片于空气中自然干燥,在冷丙酮中固定4h或过夜,然后在冷磷酸盐缓冲盐水中轻轻漂洗,取出后干燥,在标本区周围用记号笔划圈,立即染色检查,或密封于塑料袋中,置-20℃暂时保存。

  
3.3.2 细胞培养物标本片制备

  
接种了被检病料的细胞培养物(如神经母细胞瘤细胞),继续在二氧化碳恒温箱中培养48h,随后用橡皮刮子刮取细胞泥在载玻片上制成薄而均匀涂片。当以盖玻片为载体生长的细胞培养物时,则可直接取此长满细胞单层的盖玻片作为标本片。然后按3.3.1.2风干、固定和保存。

  
3.4 染色

  
3.4.1 用吸管吸取稀释的狂犬病荧光抗体,滴加1~2滴于经丙酮固定的标本片上,使其布满整个标本区。

  
3.4.2 将标本片置于搪瓷盘内(盘底垫以浸湿的纱布,纱布上放玻片架),放37℃恒温箱内着染30min。

  
3.4.3 取出玻片,用磷酸盐缓冲盐水轻轻冲去玻片上多余的染色液,再将玻片连续通过3缸(或杯)磷酸盐缓冲盐水,每缸浸泡3min,并不时轻轻振荡。最后在蒸馏水中浸泡3min。

  
3.4.4 在吸水纸上轻轻磕尽玻片上的蒸馏水,自然干燥后,于标本区上滴加1滴甘油缓冲液(分析纯中性甘油9份,pH7.4磷酸盐缓冲盐水11份),覆盖玻片扣于载玻片上,然后镜检。

  
3.5 对照设置

  
3.5.1 已知狂犬病病毒标本片加狂犬病荧光抗体染色应有特异荧光出现。

  
3.5.2 已知狂犬病病毒标本加狂犬病未标记抗体阻抑后,再加狂犬病荧光抗体染色,应无特异荧光出现。

  
3.5.3 已知狂犬病病毒阴性标本片加狂犬病荧光抗体染色,应无特异荧光出现。

  
3.6 荧光显微镜检查及判定

  
一般用蓝紫光,激发滤光片用BG12 :,吸收滤光片用OG1或GG9,以满足异硫氰酸荧光黄的荧光谱要求为准。暗视野聚光器比明视野聚光器易于观察特异性荧光。物镜浸油须用无荧光镜油,也可以封片用的甘油缓冲液代替。先检查对照标本。只有在对照标本的染色结果符合3.5.1—3.5.3要求时才能去检查被检标本。特异性荧光呈亮绿至黄绿色,背景细胞染成淡黄或橙红色,细胞核成暗红色。狂犬病特异性荧光颗粒较大,数量不等,位于细胞浆内。凡在神经细胞胞浆内发现特异性荧光,均应判为狂犬病病毒感染者。

  
4 小鼠和细胞培养物感染试验

  
4.1 材料准备

  
4.1.1 器材:细胞培养瓶(或管),二氧化碳恒温箱,微量超滤器(滤膜孔径0.45um),微量组织研磨器,普通离心机及离心管,0.25mL注射器及针头等。

  
4.1.2 试剂:0.5%水解乳蛋白汉克氏(Hanks)液,伊格尔氏(Eagle)最低要素培养液(EMEM),犊牛血清,20000IU/mL青霉素溶液,20000ug/ mL链霉素溶液等。

  
4.1.3 小鼠:无特定病原(SPF)易感小鼠,5~7日龄(也可用3~4周龄者,但发病时间可能稍推迟)。

  
4.1.4 仓鼠肾传代细胞(BHK21)或小鼠神经母细胞瘤(NACl300)细胞。

  
4.2 样品的采取和运送

  
除可按照2.2的方法和要求送检新鲜脑组织外,还应采集唾液送检。方法是:用灭菌吸管吸取或用灭菌棉拭棒蘸取腮腺口附近的唾液,置入lmL~2mL内含2%灭活豚鼠血清和抗生素的Hanks液中,低温保存备用。

  
4.3 样品的处理

  
脑组织用组织研磨器磨碎,加0.5%水解乳蛋白Hanks液制成20%(m/V)混悬液,以3000r/min离心30min,吸取上清液,加入青霉素500IU/mL和链霉素500ug/mL,在4℃处理3h~4h,即可用于感染小鼠和细胞培养物的接种样品。唾液样品亦需经上述离心和杀菌处理。怀疑有污染的样品,可用0.45um微孔滤膜过滤法处理。

  
4.4 感染方法

  
4.4.1 小鼠感染法

  
每份样品用小鼠4~6只。左手固定小鼠,在耳与眼之间用碘酒消毒。右手持吸取接种样品的0.25mL注射器在消毒部位刺人硬脑膜下,每只小鼠注射0.03mL。对照小鼠2只,按同法同剂量注射稀释液(即0.3%水解乳蛋白Hanks液)。每天早晚各观察1次,记录是否有发病小鼠。至少观察28d。

  
4.4.2 细胞培养物感染法

  
每份样品接种4~管细胞培养物。取接近长成单层的细胞培养物用Hanks液轻洗3次,每管接种样品0.1mL~0.2mL,在37℃恒温箱内吸附1h,用Hanks液洗1次(亦可不洗)加人含有1%~2%犊牛血清的EMEM液(添加量随细胞瓶大小而定),放二氧化碳恒温箱(37℃)内继续培养。同时设细胞对照2管,以0.5%水解乳蛋白Hanks液替代样品上清液。每天观察1次,记录是否有致细胞病变作用(CPE)出现。至少观察15d。

  
4.5 感染性鉴定

  
4.5.1 小鼠感染性鉴定

  
若对照小鼠健活,而样品接种小鼠在接种后4d~7d开始发病,呈现痉挛、麻痹等神经症状并死亡,可确诊为狂犬病感染者。如果症状不典型,可扑杀取脑,采用内基氏小体检查或免疫荧光试验鉴定之。如果7d后不发病,可将其中2只小鼠放血致死,取脑作成10%(m/V)混悬液,接种健鼠盲目传代;第2代在7d左右还不发病时,再盲传1代;至第3代经4周观察仍不发病时,可报告狂犬病小鼠感染试验阴性。对观察期间死亡的小鼠,应进行内基氏小体检查或免疫荧光检查以鉴别之。

  
4.5.2 细胞培养物感染性鉴定

  
若对照细胞培养物正常,而样品接种的细胞培养物不论是否出现细胞病变,但经免疫荧光试验证实有特异性荧光时,可确诊为狂犬病感染者。为缩短检验时间,可在接种后48h抽取1—2管细胞培养物进行免疫荧光试验。对既无细胞病变又无特异性荧光反应者,应再盲传2次。第3代经15d观察仍无细胞病变和特异性荧光时,可报告狂犬病细胞培养物感染试验阴性。

  


  
附 录 A
( 标准的附录)
染色液的配制

  
A.1 塞勒(Seller)氏染色液

  
母液I:美蓝饱和溶液

  
碱性美蓝 2.0g

  
无水甲醇(分析纯) 100.0mL

  
母液Ⅱ:复红饱和溶液

  
碱性复红 40.0g

  
无水甲醇(分析纯) 100.0mL

  
母液Ⅲ:无水甲醇(分析纯)

  
使用液:取母液Ⅰ15mL与母液Ⅲ25mL混合,再加入母液Ⅱ2mL~4mL,充分混合,装入褐色瓶中,塞紧瓶塞保存备用。此染色液配制时间越久,染色效果越好。

  
A.2 曼(Mann)氏染色液

  
1.0g/100mL甲基蓝水溶液 35mL

  
1.0g/l00mL伊红水溶液 35mL

  
加蒸馏水至 l00mL

  
配制时,在甲基蓝水溶液和伊红水溶液分别过滤后,各取35mL,再加蒸馏水补足l00mL。

  
A.3 碱性乙醇溶液

  
取无水乙醇30mL,加1.0g/l00mL氢氧化钠溶液5滴(约0.3mL~0.4mL)即成。

  
A.4 徽酸性水溶液

  
取蒸馏水30mL,加纯冰乙酸溶液4~5滴(约0.3mL)即成。

  
附 录 B

  
人身防护

  
(提示的附录)

  
B.1 从事狂犬病可疑动物解剖和检疫检验的人员。有穿戴工作服、手套、口罩和防护眼镜,防止感染性病料或气溶胶进入粘膜和伤口。工作期间不准吸烟、喝水、吃东西。工作结束时,要洗手洗脸和消毒。

  
B.2 被狂犬病可疑动物咬伤者,应立即用大量20%肥皂水、0.1%新洁尔灭溶液或清水充分冲洗,再用75%酒精或2%—3%碘酒消毒,彻底清理伤口,注射狂犬病疫苗。必要时,应同时注射狂犬病免疫血清(或精制免疫球蛋白)。

  
B.3 尸体剖检工作应在病理解剖室内或其他安全地点进行。采完病料之后,应将尸体连同污物一起焚毁或深埋,不得留作它用。污染的场地、器械和工作服等应彻底消毒。

  
B.4 作活检的狂犬病可疑动物,在确诊为非狂犬病感染动物之前,应将之严格隔离,防止侵袭其他人畜。

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