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人白细胞介素12两个亚基基因p35 、p40 拼接的新方法

2012-08-07来源:山东畜牧网访问次数:字号:[ ]
  白细胞介素12 ( interleukin-12 , IL-12) , 又称自然杀伤细胞刺激因子(NKSF) 或细胞毒淋巴细胞成熟因子(CLMF) , 它具有众多的生物学功能, 在机体抗感染和抗肿瘤过程中发挥着重要作用。IL-12 蛋白是由P35 及P40 两个亚基通过二硫键交连而成。两个亚基必须同时在细胞内表达才能产生有完整生物学活性的IL-12 。所以, 在进行人IL-12 的体外表达、生物学功能研究以及进行基因治疗时, 如何使两个亚基基因表达比例适当,产生具有完整生物学活性的蛋白是非常重要的。在IL-12 基因研究过程中, 常将两个亚基基因由某一肽段基因相连, 形成一条肽链, 表达产物自行相连, 形成IL-12 蛋白, 这样实现人IL-12 两个亚基基因在细胞内以相同的比例同步共表达, 完全保证两个亚基的有效连接, 使基因转录以及翻译水平的表达在体内顺畅进行, 保证IL-12 蛋白三维结构的正确折叠等翻译后的修饰加工。
  研究者采用多种分子克隆技术将两个亚基利用连接肽基因进行有效地拼接, 如将p35 、p40 基因及连接肽基因用一定的酶切, 逐一连于表达载体。这一方法原理比较简单, 但过程繁琐、耗时。利用聚合酶链反应( cpolymerase chainreaction , PCR) 重叠延伸的方法将p35 、p40 基因及连接肽基因连接在一起。虽然过程简单, 但反应条件需要摸索, 同时, 由于重叠PCR 反应的复杂性, 使其特异性较差, 为后续克隆挑选带来一定的难度。因此, 本研究拟探索一种简单、方便有效的利用连接肽基因将两个亚基基因相连的分子克隆方法。
  1  材料与方法
  1.1  实验材料 
  质粒pED ( EMC-3 )-p40 和pED ( EMC-3) -p35由英国伦敦大学孙英博士惠赠; pMD182Tvector 和限制性内切酶Kpn Ⅰ、X ho Ⅰ、N ot Ⅰ购自大连宝生物公司; 凝胶回收试剂盒购自维杭州特洁公司; 质粒小量快速提取试剂盒购自北京博大泰克公司; Taq DNA 聚合酶、T4 DNA连接酶、dN TP 购自MBI 公司; JM109菌株为本科保存。
  1.2  p40 、p35 基因片段的获得 根据GenBank 上的p40 、p35 基因序列, 设计引物(由上海生工公司合成) 。p40 引物: 上游引物: 5′- AAA TA TGCGGCCGCTAA GCCACCA T-GGGTCAC-3′, 在5′端引入N ot I 酶切位点, 下游引物: 5′-GGCAGGTACCCCTACTCCA GGAAC-CA TTCGCTCCAA GA TGA GCT-3′, 在5′引入Kp n I 酶切位点; p35 引物: 上游引物: 5′- A TC2CGGTACCTGGGGTGGGCGCCA GAAACCTCC-CCGTGGCCA-3′, 5′端引入Kp n I 酶切位点, 下游引物: 5′- CCGCTCGA GCGTTA GGAA GCA T-TCA GA TA G-3′, 5′端引入X ho I 酶切位点。在p40 下游引物和p35 下游引物引入两个亚基基因连接的连接肽基因, 为GTTCCTGGA GTA GGGG-TACCTGGGGTGGGC , 内部含有Kp n Ⅰ酶切位点。分别以质粒p ED ( EMC-3 ) -p40 、p ED(EMC-3) -p35 为模板, 应用Taq DNA 聚合酶及上述引物扩增p40 、p35 基因片段。p40 基因片段PCR 反应条件为: 95 ℃预变性5 min , 94 ℃变性1 min , 58 ℃退火45 s , 72 ℃延伸1 min , 共30 个循环, 末次循环后72 ℃延伸10 min 。p35 基因片段PCR 反应条件为95 ℃预变性5 min , 94 ℃变性1 min , 56 ℃退火45 s , 72 ℃延伸45 s , 共30 个循环, 末次循环后72 ℃延伸10 min 。PCR 产物通过1 %琼脂糖凝胶电泳予以鉴定。
  1.3  p40 、p35 基因片段拼接 
  PCR 产物利用凝胶回收试剂盒按说明回收纯化。用Kp n Ⅰ酶切纯化的p40 、p35 基因PCR 产物, 酶切片段用凝胶回收试剂盒按说明回收纯化。应用T4 DNA 连接酶对纯化的酶切片段进行连接。以连接产物为模板, 应用Taq DNA 聚合酶、p40上游引物和p35 下游引物进行连接产物的PCR 扩增。PCR 反应条件为95 ℃预变性5 min , 94 ℃变性1 min , 58 ℃退火45 s , 72 ℃延伸1 min 30 s , 共30 个循环, 末次循环后72 ℃延伸10 min 。PCR 产物通过1 %琼脂糖凝胶电泳予以鉴定。
  1.4  p40 、p35 基因片段拼接产物的克隆与鉴定
  连接产物的PCR 产物利用凝胶回收试剂盒按说明回收纯化。得到的目的拼接片段应用Kp n Ⅰ酶切鉴定。目的拼接片段与pMD18-Tvector 进行连接, 并转化大肠杆菌JM109 , 经蓝白筛选, 随机挑取白色菌落, 扩菌后应用质粒小量快速提取试剂盒按说明提取质粒, 以N ot Ⅰ和X ho Ⅰ双酶切,通过1 %琼脂糖凝胶电泳予以鉴定。酶切鉴定正确后再送交上海生工测序中心进行测序鉴定。
  2  结 果
  2.1  p40 和p35 基因PCR 产物的1 %琼脂糖凝胶电泳 
PCR 产物的琼脂糖凝胶电泳结果可见: 在约1 000 bp处可见单一的条带, 与p40 基因片段大小相一致; 在约600 bp 处可见单一的条带, 与p35 基因片段大小相一致, 见图1 。
  



  2.2  p40 、p35 基因片段拼接结果 
  1 %琼脂糖凝胶电泳结果可见: 在约1 600 bp处可见单一的条带, 与设计的拼接产物大小一致;拼接产物经Kp n I 酶切后在约1 000 和600 bp 处可见2 条带, 分别与p40 及p35 基因片段大小一致, 见图2 。


  



  2.3  p40 与p35 基因片段拼接产物克隆结果
  2.3.1  克隆质粒酶切鉴定 pMD18-IL-12 阳性重组克隆通过N ot Ⅰ和X ho Ⅰ双酶切, 可见在1 600 bp 处出现酶切产物, 与拼接产物大小相一致, 见图3 。


  



  2.3.2  p40 与p35 基因片段拼接产物序列测定结果 将拼接产物测序获得的核苷酸序列与p40 和p35 基因的核苷酸序列以及连接肽的基因序列进行比对, 结果表明, 二者核苷酸序列完全一致。部分测序结果, 见图4 。


  



  3  讨 论
  IL-12 是由巨噬细胞、树突状细胞等抗原提呈细胞产生的相对分子质量为70 000 的蛋白质, 由不同基因编码的两个亚基P35 与P40 两条肽链借二硫键的形成结合在一起的异二聚体细胞因子。人IL-12编码p35 、p40 两基因分别定位于第3 号和第5 号染色体。P35 、P40 亚基两者单独存在时无生物学作用, 只能结合后才具有生物学活性。IL-12表达的调控机制比较复杂, 其异二聚体的产生需要编码p40 和p35 的两个基因的同时表达。所以在进行IL-12 基因表达时, p40 和p35 基因的表达方式尤为重要。
  对于IL-12 基因的体外表达主要包括以下几种策略: ①同时将分别携带p35 、p40 基因的表达载体转染真核细胞, 形成两条肽链, 相互连接形成IL-12; ②将p35 、p40 两基因分别构建于同一载体的两个相同或不同启动子的下游, 分别转录并翻译形成两条肽链, 相互连接形成IL-12;③将p35 、p40 两基因用一串核苷酸连接成一个融合基因, 在同一载体由同一启动子驱动表达, 形成一条mRNA , 若两个基因由核糖体进位位点(IRES) 相连, 将形成两条肽链, 相互相连, 形成IL-12 。但不能保证两个亚基翻译水平表达比例完全相同; 若两个基因由连接肽基因相连, 则形成一条肽链, 自行相连, 形成IL-12 , 这样可以完全保证两个亚基的有效连接, 这种方法也是最为常见的基因拼接策略。


  两个亚基基因通过连接肽基因相连的常用分子克隆方法是以质粒为操作载体将p35 、p40 两基因及连接肽基因用一定的酶切, 逐一连于质粒载体上。这一方法原理比较简单, 但需要至少两步以上的克隆质粒的细菌转化以及验证过程, 同时需要多个酶切位点的选择, 应用多个限制性内切酶, 过程繁琐, 克隆时间长。有的研究者利用PCR 重叠延伸的方法将p35 、p40 两基因及连接肽基因连接在一起。在p40 基因设计的下游引物与p35 基因设计的上游引物中含有互补的连接肽基因序列。通过互补序列的相互配对, 再利用PCR 直接将p35 、p40两基因相连接。这一方法过程简单, 需要的时间较短。但该技术的反应条件难以把握, 需要反复摸索, 并且PCR 产物具有一定的复杂性, 产物多样,为PCR 产物进一步克隆的筛选带来一定的难度。基于上述考虑, 本研究利用同一种酶切两个亚基产生的黏性末端, 通过连接酶连接后, 对连接产物进行PCR , 从而获得拼接产物。
  本研究采用的连接肽基因序列来源于牛弹性蛋白基序, 被Invivogen 公司证明是有效的连接p35 、p40 两个亚基基因的连接肽。利用分子生物学软件对设计的拼接基因全序列进行分析, 发现在连接肽基因序列存在整个序列的多个单一酶切位点, 从中选择常用的限制性内切酶Kp n Ⅰ。p40 引物的下游5′末端含有连接肽基因并具有Kp n Ⅰ酶切位点,而p35 引物的上游5′末端含有连接肽基因并具有Kp n Ⅰ酶切位点。这样p35 、p40 两个亚基基因PCR 产物经Kp n Ⅰ酶切后产生互补的黏性末端,在DNA 连接酶的作用下, p35 、p40 两个亚基基因通过连接肽基因易连接。连接产物通过p40 上游引物与p35 下游引物进行PCR 得以扩增。因此,本研究只利用一步酶切、一步连接、两步PCR 就完成了p35 、p40 两基因的拼接。通过克隆与测序分析, 表明p35 、p40 两基因片段成功地被拼接在一起。该方法既简化了逐一连接基因片段的多步克隆筛选的烦琐过程, 同时又避免了PCR 重叠延伸方法的复杂性及特异性较差的缺点。所以该方法简便、快速, 同时具有特异性, 是一种非常有效的利用连接肽基因进行p35 、p40 两基因连接的方法。该方法所提供的基因拼接策略不仅仅用于本研究而且可以用于其他需要多个基因拼接的研究。


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