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深部真菌感染的分子生物学检测研究进展

2012-08-07来源:山东畜牧网访问次数:字号:[ ]
    深部真菌感染指真菌侵犯皮下组织、黏膜和内脏所引起的感染性疾病, 包括局限性的单一器官感染和2个或2个以上器官或组织受侵犯的系统性真菌感染。深部真菌感染发病率逐年增高, 其病死率高, 症状变化多样, 早期诊断方法有限。本文就分子生物学方法在深部真菌感染诊断中的研究现状作一综述。
  1 流行现状
  深部真菌感染多发生在医院内, 主要由念珠菌、曲霉菌和隐球菌所致。其中念珠菌仍是血液系统感染的主要致病菌。念珠菌感染中以白色念珠菌、热带念珠菌感染多见, 但近年来随着新一代抗真菌药物的应用, 光滑念珠菌和克柔念珠菌感染患者增多, 并出现耐药。曲霉菌是继念珠菌之后第二常见的真菌病原体, 脏器移植患者的曲霉菌感染发生率高达30% , 病死率达60%~90%。隐球菌的主要致病类型是新型隐球菌, 隐球菌感染是艾滋病常见的并发症。
  一项覆盖64% 丹麦人群的调查发现, 2004/2006 年的真菌血症的年平均发病率为10. 4/100 000, 每年增加17%。流行病学显示不仅病原菌的种类发生了变化, 且随着新型抗真菌药物的应用, 真菌的耐药性也发生了变化。Sar等利用Etest法检测402株新型隐球菌对氟康唑的敏感性, 2a间对氟康唑耐药的菌株增加了11. 5%。
  2 深部真菌感染的非培养方法
  2. 1 血清学检测 目前应用于临床真菌血清学检测方法主要是检测血循环中的抗原, 包括β-D-1, 3葡聚糖(BDG)和半乳甘露聚糖(GM)。BDG 是除接合菌和隐球菌以外的真菌胞壁的主要成分之一, 不存在于细菌、病毒和人类细胞中, 是一种真菌广谱循环标志物可用于念珠菌病及曲霉病的早期诊断。GM是存在于曲霉和青霉细胞壁上的一种热稳定多糖, 是第一个用于侵袭性曲霉病的抗原, 其商品化检测试剂盒在欧洲已经使用了10a余, 美国也于近年批准临床使用。GM检测标本可以使用血液或支气管肺泡灌洗液以及尿液、脑脊液等标本。血清学方法方便快速, 然而不能精确到真菌的种, 对治疗用药有一定影响; 且某些食物、药物也可影响检测结果, 目前没有广泛应用于临床。
  2. 2 分子生物学方法 DNA指纹技术包括限制性片断长度多态性分析(RFLP)、随机扩增多态性分析(RAPD)、电泳核型(elect ropho ret ic karyo type) 等。对于已知分类的微生物, 可通过DNA 片断比较株系间的同源差异, 对于未知微生物需通过标准菌种DNA 指纹图库比较后确定。
  基于聚合酶链反应(PCR) 的分子生物学方法如巢式PCR、实时荧光定量PCR 等是目前真菌感染诊断中最活跃的领域, 关键是根据目的基因设计合适的引物。最常选用的目的片段是rDNA 复合体。真核生物编码核糖体核酸的基因(rDNA)是一个串联的重复转录单位, 即18S rDNA-ITS-5. 8S rDNA-28SrDNA , 约100~ 200 拷贝, 包括编码区和非编码区; 分隔编码区18S、5. 8S、28S rDNA 亚单位的ITS 为非编码区。编码区序列相对保守, 而ITS 在两代之间进化很快, 常发生变异, 在同一属种间甚或种内可有不同程度的差异, 所以rDNA ITS 序列具有菌种分类鉴定的意义。
  3 分子生物学方法的研究现状
  DNA 指纹分型技术可以做到准确分类鉴定病原但主要用于流行病分型研究。近来将RFLP、PCR与杂交技术结合起来,对PCR产物进行RFLP分析可弥补单纯RFLP分析时结果模糊之缺陷。Asticcioli等用RAPD方法证实在一新生儿重症监护病房中爆发流行的深部念珠菌病为两株白色念珠菌所致。电泳核型是把整个染色体包埋在琼脂糖凝胶中, 依赖染色体的大小和立体结构, 通过在凝胶中迁移的速度把基因组分离成染色体带。Shin等在36d内从15位光滑念珠菌血症患者血中分离出得到41 株光滑念株菌, 用PFGE技术发现同一患者血中连续分离得到的光滑念珠核型在迅速地发生变化并证实光滑念珠菌对唑类药物耐药性的获得与使用该类药物治疗所致诱导耐药相关。各种改良的PCR技术可以简便、快速地鉴定多种医学重要真菌。(1) 巢式PCR (nested PCR):使用巢式引物进行多轮扩增可提高特异性和灵敏度。Margit等用巢式PCR方法检测深部感染烟曲霉的动物模型, 检测下限达1CFU/ml。Hummel等用相同方法检测了疑似脑曲霉病的6 位血液系统恶性肿瘤患者的脑脊液, PCR结果临床症状有良好的相关性。在巢式PCR 研究中要特别避免出现假阳性, 环境中存在着大量曲霉孢子很容易对样本和试剂造成污染应通过严格实验室检测规范以及设置对照来控制。(2) 多重(mult ip lex PCR ) : Carvalho 等用一对通用引物结合八个种特异引物扩增ITS125. 8sRNA-ITS2片断, 可同时鉴定出8种念珠菌, 精确度可达2 CFU/ml, 可在5h内得到结果。Giorgio等利用多重PCR方法直接检测口腔念珠菌患者的口腔清洗液标本, 可以鉴定10种念珠菌, 且将检测时间也短至5h。(3) 实时定量PCR: 精确地定量出测样品中的基因数量, 利于PCR质量控制标准的建立。Vo llmer 等依据28SrDNA 基因的部分序列设计广谱引物用实时定量PCR 来检测可将对人致病的重要真菌鉴定到属, 包括曲霉属, 假丝酵母菌属, 毛霉属, 隐球菌属等。他们用这种方法检测了呼吸机支持通气的重症监护患者的76 份气管抽吸物标本和患有感染性心内膜炎的患者的70 份瓣膜组织标本。临床上通过组织病理学检查很难将接合菌与其他丝状真菌鉴别, 但使用荧光定量PCR 技术, 根据接合菌高度保守的细胞色素b 基因序列来设计特异引物和杂交针探可以鉴定出检测新鲜组织样品中小克银汉霉属、毛霉属、根霉菌属等五种接合菌, 敏感性和特异性均为100%。
深部真菌感染指真菌侵犯皮下组织、黏膜和内脏所引起的感染性疾病, 包括局限性的单一器官感染和2个或2个以上器官或组织受侵犯的系统性真菌感染。深部真菌感染发病率逐年增高, 其病死率高, 症状变化多样, 早期诊断方法有限。本文就分子生物学方法在深部真菌感染诊断中的研究现状作一综述。
  1 流行现状
  深部真菌感染多发生在医院内, 主要由念珠菌、曲霉菌和隐球菌所致。其中念珠菌仍是血液系统感染的主要致病菌。念珠菌感染中以白色念珠菌、热带念珠菌感染多见, 但近年来随着新一代抗真菌药物的应用, 光滑念珠菌和克柔念珠菌感染患者增多, 并出现耐药。曲霉菌是继念珠菌之后第二常见的真菌病原体, 脏器移植患者的曲霉菌感染发生率高达30% , 病死率达60%~90%。隐球菌的主要致病类型是新型隐球菌, 隐球菌感染是艾滋病常见的并发症。
  一项覆盖64% 丹麦人群的调查发现, 2004/2006 年的真菌血症的年平均发病率为10. 4/100 000, 每年增加17%。流行病学显示不仅病原菌的种类发生了变化, 且随着新型抗真菌药物的应用, 真菌的耐药性也发生了变化。Sar等利用Etest法检测402株新型隐球菌对氟康唑的敏感性, 2a间对氟康唑耐药的菌株增加了11. 5%。
  2 深部真菌感染的非培养方法
  2. 1 血清学检测 目前应用于临床真菌血清学检测方法主要是检测血循环中的抗原, 包括β-D-1, 3葡聚糖(BDG)和半乳甘露聚糖(GM)。BDG 是除接合菌和隐球菌以外的真菌胞壁的主要成分之一, 不存在于细菌、病毒和人类细胞中, 是一种真菌广谱循环标志物可用于念珠菌病及曲霉病的早期诊断。GM是存在于曲霉和青霉细胞壁上的一种热稳定多糖, 是第一个用于侵袭性曲霉病的抗原, 其商品化检测试剂盒在欧洲已经使用了10a余, 美国也于近年批准临床使用。GM检测标本可以使用血液或支气管肺泡灌洗液以及尿液、脑脊液等标本。血清学方法方便快速, 然而不能精确到真菌的种, 对治疗用药有一定影响; 且某些食物、药物也可影响检测结果, 目前没有广泛应用于临床。
  2. 2 分子生物学方法 DNA指纹技术包括限制性片断长度多态性分析(RFLP)、随机扩增多态性分析(RAPD)、电泳核型(elect ropho ret ic karyo type) 等。对于已知分类的微生物, 可通过DNA 片断比较株系间的同源差异, 对于未知微生物需通过标准菌种DNA 指纹图库比较后确定。
  基于聚合酶链反应(PCR) 的分子生物学方法如巢式PCR、实时荧光定量PCR 等是目前真菌感染诊断中最活跃的领域, 关键是根据目的基因设计合适的引物。最常选用的目的片段是rDNA 复合体。真核生物编码核糖体核酸的基因(rDNA)是一个串联的重复转录单位, 即18S rDNA-ITS-5. 8S rDNA-28SrDNA , 约100~ 200 拷贝, 包括编码区和非编码区; 分隔编码区18S、5. 8S、28S rDNA 亚单位的ITS 为非编码区。编码区序列相对保守, 而ITS 在两代之间进化很快, 常发生变异, 在同一属种间甚或种内可有不同程度的差异, 所以rDNA ITS 序列具有菌种分类鉴定的意义。
  3 分子生物学方法的研究现状
  DNA 指纹分型技术可以做到准确分类鉴定病原但主要用于流行病分型研究。近来将RFLP、PCR与杂交技术结合起来,对PCR产物进行RFLP分析可弥补单纯RFLP分析时结果模糊之缺陷。Asticcioli等用RAPD方法证实在一新生儿重症监护病房中爆发流行的深部念珠菌病为两株白色念珠菌所致。电泳核型是把整个染色体包埋在琼脂糖凝胶中, 依赖染色体的大小和立体结构, 通过在凝胶中迁移的速度把基因组分离成染色体带。Shin等在36d内从15位光滑念珠菌血症患者血中分离出得到41 株光滑念株菌, 用PFGE技术发现同一患者血中连续分离得到的光滑念珠核型在迅速地发生变化并证实光滑念珠菌对唑类药物耐药性的获得与使用该类药物治疗所致诱导耐药相关。各种改良的PCR技术可以简便、快速地鉴定多种医学重要真菌。(1) 巢式PCR (nested PCR):使用巢式引物进行多轮扩增可提高特异性和灵敏度。Margit等用巢式PCR方法检测深部感染烟曲霉的动物模型, 检测下限达1CFU/ml。Hummel等用相同方法检测了疑似脑曲霉病的6 位血液系统恶性肿瘤患者的脑脊液, PCR结果临床症状有良好的相关性。在巢式PCR 研究中要特别避免出现假阳性, 环境中存在着大量曲霉孢子很容易对样本和试剂造成污染应通过严格实验室检测规范以及设置对照来控制。(2) 多重(mult ip lex PCR ) : Carvalho 等用一对通用引物结合八个种特异引物扩增ITS125. 8sRNA-ITS2片断, 可同时鉴定出8种念珠菌, 精确度可达2 CFU/ml, 可在5h内得到结果。Giorgio等利用多重PCR方法直接检测口腔念珠菌患者的口腔清洗液标本, 可以鉴定10种念珠菌, 且将检测时间也短至5h。(3) 实时定量PCR: 精确地定量出测样品中的基因数量, 利于PCR质量控制标准的建立。Vo llmer 等依据28SrDNA 基因的部分序列设计广谱引物用实时定量PCR 来检测可将对人致病的重要真菌鉴定到属, 包括曲霉属, 假丝酵母菌属, 毛霉属, 隐球菌属等。他们用这种方法检测了呼吸机支持通气的重症监护患者的76 份气管抽吸物标本和患有感染性心内膜炎的患者的70 份瓣膜组织标本。临床上通过组织病理学检查很难将接合菌与其他丝状真菌鉴别, 但使用荧光定量PCR 技术, 根据接合菌高度保守的细胞色素b 基因序列来设计特异引物和杂交针探可以鉴定出检测新鲜组织样品中小克银汉霉属、毛霉属、根霉菌属等五种接合菌, 敏感性和特异性均为100%。

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